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全自動質粒提取系統 Biorobot3000_德國amaxa公司

發布日期:08-22 17:43 分類:儀器儀表 閱讀次數:806 點擊訪問移動網站

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摘要所在單位儀器編號:1251中文名稱:全自動質粒提取系統生產制造商:德國amaxa公司規格型號:Biorobot3000主要技術指標:自動96/384孔板加樣系統主要功能及特色:根據客戶的不同需要量身定 ...

所在單位儀器編號:1251
中文名稱:全自動質粒提取系統
生產制造商:德國amaxa公司

規格型號:Biorobot3000
主要技術指標:自動96/384孔板加樣系統
主要功能及特色:根據客戶的不同需要量身定做分子生物學平臺。軟件功能強大,用途廣泛龙8国际娱乐网龙8国际娱乐网。在平臺上可以進行吸液、分液龙8国际娱乐网、稀釋、混合、振蕩、過濾龙8国际娱乐网、依次移液等生物學實驗室中常用的工作,使得BioRobot3000既可以自動完成核酸、重組蛋白純化龙8国际娱乐网,也可用于移液龙8国际娱乐网。根據客戶的需要還可以設計成與各類儀器整合使用,如PCR儀、酶標儀等,能滿足各種實驗需要。
主要學科領域:
儀器主要用途:教育
所屬單位:西南大學

 

質粒DNA提取實驗


質粒DNA提取可以:

(1)快速純化質粒;(2)用于測序龙8国际娱乐网、體外轉錄與翻譯、限制性內切酶消化、細菌轉化等分子生物學實驗。

實驗方法原理:

堿裂解法是基于DNA的變性與復性差異而達到分離目的的。堿性使質粒DNA變性,再將pH值調至中性使其復性龙8国际娱乐网,復性的為質粒DNA,而染色體DNA不會復性,纏結成網狀物質,通過離心除去龙8国际娱乐网。

 

實驗步驟:

一、材料與試劑準備

1.  材料:大腸桿菌龙8国际娱乐网。

2.  儀器:超凈工作臺,培養箱,搖床,恒溫水浴鍋,臺式離心機,取液器一套,低溫冰箱,冷凍真空干燥機龙8国际娱乐网,電泳儀,水平電泳槽,紫外觀測儀。

3.  試劑:

(1)Solution I :25 mM Tris-Hcl(pH7.4),10 mM EDTA(pH8.0),50 mM葡萄糖龙8国际娱乐网,高壓滅菌,4℃保存。

 

質粒提取的幾種方法及原理

 

1龙8国际娱乐网、堿裂解法原理:


根據共價閉合環狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環境下,細菌的細胞壁和細胞膜被破壞,基因組DNA和質粒DNA被釋放出來,線性DNA雙螺旋結構被破壞而發生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環狀質粒DNA也會發生變性龙8国际娱乐网,但兩條互補鏈仍會互相盤繞,并緊密的結合在一起龙8国际娱乐网。


當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時,共價閉合環狀質粒DNA復性快,而線性的染色體DNA復性緩慢,細菌蛋白質龙8国际娱乐网、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物,后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時,復合物會從溶液中有效地沉淀下來龙8国际娱乐网,離心除去變性劑后,就可以從上清中回收復性的質粒DNA龙8国际娱乐网。


2、煮沸法裂解:


將細菌懸浮于含Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中,然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外,還有助于解開DNA鏈的堿基配對,并使蛋白質和染色體DNA變性龙8国际娱乐网。但是,閉環質粒DNA彼此不會分離,這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構,當溫度下降后,閉環DNA的堿基又各自就位,形成超螺旋分子,離心除去變性的染色體核蛋白質龙8国际娱乐网,就可從上清中回收質粒DNA。


煮沸裂解法對于小于15kb的小質粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制備),多至250mL(大量制備)菌液的質粒,并且對大多數的大腸桿菌菌株都適用。


質粒提取的常見問題及解決辦法


1、菌液較多:可以通過幾次離心將菌體沉淀收集到一個離心管中。收集的菌體量以能夠充分裂解為佳,菌體過多裂解不充分會降低質粒的提取效率。未徹底混勻的菌塊會影響裂解,導致提取量和純度偏低,菌體懸浮后若有較多的氣泡也會影響裂解,導致導致提取量和純度偏低龙8国际娱乐网。


解決辦法:質粒提取使用的溶液I主要是懸浮菌體,溶液II裂解菌體,其中的高濃度NaOH破會細菌細胞壁和細胞膜,使菌體中的質粒DNA釋放出來,溶液III主要是中和溶液,使溶液恢復中性環境龙8国际娱乐网,利于質粒DNA復性龙8国际娱乐网,溶液II中SDS的Na+會被K+置換,SDS變為PDS并結合大分子的基因組DNA,蛋白質和細胞碎片形成不溶物,然后通過離心可以得到含有質粒DNA的上清。


因此加入溶液II后要溫和地混合,不要劇烈震蕩,以免使基因組DNA斷裂污染質粒。所用時間不應超過5min龙8国际娱乐网,以免質粒受到破壞。如果菌液沒有變清亮,可能是由于菌體過多,裂解不徹底,若繼續進行后續操作會得到鼻涕狀的沉淀,無法通過離心分離得到含有DNA 的上清液,因此在加入溶液Ⅱ后菌液沒有變清亮后可以適當按比例加大溶液Ⅱ和后續溶液Ⅲ的用量。


2、菌液培養時間:使用TB培養基培養菌液的時間一般在17小時左右,菌液OD值在2.5-2.6左右為佳,培養時間短會導致菌體生長不充分龙8国际娱乐网,培養時間過長菌體會出現死亡,都會影響收集的菌體量,從而影響抽提出的質粒DNA的量。在接菌前,可以將保存的菌種先進行活化龙8国际娱乐网,然后再接菌,可使過夜培養的菌液生長更充分,在一定范圍內菌體量的增加,可以提高所提質粒的濃度。


3、宿主菌株:宿主菌株的種類將會影響質粒的收獲量。含內源核酸酶的宿主菌株,HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它們的衍生菌株,通常因為內源核酸酶的存在,或者在提取過程中釋放出來的核酸酶的作用下龙8国际娱乐网,將會顯著影響最終收獲量,或者純化到的質粒容易降解,推薦將質粒轉化至不含內源核酸酶的宿主菌株中,如Top10, DH5a進行質粒純化。


4、質??截悢档停?/strong>由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低,可更換具有相同功能的高拷貝數載體,或者加大提取的菌液量,并減小洗脫時的體積。


5、菌體中無質粒:有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在,經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如,柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定龙8国际娱乐网,因此不要頻繁轉接,每次接種時應接種單菌落。有時菌種保存一段時間后會出現質粒丟失的情況,導致無法提出質粒,若有保存的質??梢赞D化后再挑取單克隆搖菌提質粒。另外,檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確龙8国际娱乐网。


6、堿裂解不充分:使用過多菌體培養液,會導致菌體裂解不充分,可減少菌體用量或增加裂解液的用量。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會導致裂解不充分,要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對低拷貝數質粒,提取時可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液龙8国际娱乐网,可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量龙8国际娱乐网。


7、溶液使用不當:溶液II在溫度較低時可能出現渾濁,可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液,方可使用。


8、吸附柱過載:不同產品中吸附柱吸附能力不同,如果需要提取的質粒量很大龙8国际娱乐网,請分多次提取。若用富集培養基龙8国际娱乐网,例如TB或2×YT龙8国际娱乐网,菌液體積必須減少;若質粒是非常高的拷貝數或宿主菌具有很高的生長率,則需減少LB培養液體積。


9、質粒未全部溶解(尤其質粒較大時) :洗脫溶解質粒時,可適當加溫或延長溶解時間。


10、乙醇殘留:漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體,再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應(酶切、PCR等)實驗龙8国际娱乐网。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響,可置于室溫靜置20-30分鐘,或放到超凈臺上風吹15分鐘,以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液龙8国际娱乐网。


11、洗脫液加入位置不正確:洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。若第一次沒有將洗脫液準確加到硅膠膜的中心部位龙8国际娱乐网龙8国际娱乐网,可以離心后將離心下來的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。


12、洗脫液不合適:DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫,如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA,pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值龙8国际娱乐网,最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內,如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用,有利于提高洗脫效率龙8国际娱乐网。


13、洗脫體積太?。?/strong>洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高,但產品濃度降低龙8国际娱乐网。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積龙8国际娱乐网。


14龙8国际娱乐网、 洗脫時間過短:洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時在說明書的建議時間基礎上適當延長靜置或者洗脫兩次可達到較好的效果龙8国际娱乐网。

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